2020-06-24
Wako開發(fā)了含有α-葡萄糖苷酶可保證酶活性的"α-葡萄糖苷酶活性抑制檢測試劑盒"（以下均稱為"試劑盒"）。與"LabAssay™葡萄糖檢測試劑盒"配套使用（需單獨(dú)購買），可用于檢測食品對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。試劑盒中的α-葡萄糖苷酶以二糖（蔗糖和麥芽糖）作為反應(yīng)底物，可保證酶的降解活性，因此被認(rèn)為可用于測定α-葡糖苷酶活性（IC50）的抑制劑作用。試劑盒的研發(fā)及特點(diǎn)說明如下。西寶生物作為WAKO授權(quán)的一級代理，品質(zhì)保證，貨期穩(wěn)定，詳情致電400-021-8158
研發(fā)背景
近年來，日漸豐富的膳食致使肉食品攝入量增加、膳食不均衡和營養(yǎng)過剩，導(dǎo)致了糖尿病、肥胖和血脂異常等生活方式病。此外代謝綜合征的發(fā)展也日益嚴(yán)峻。
糖尿病患者數(shù)量呈上升趨勢尤為明顯。根據(jù)日本2012年的國家健康和營養(yǎng)調(diào)查推算，約有950萬人嚴(yán)重懷疑患有糖尿病，大約1,100萬人有患糖尿病可能性（糖尿病潛在人群）。
**糖尿病臨床使用的**之一就是α-葡糖苷酶抑制劑。淀粉被淀粉酶分解生成麥芽糖等二糖，α-葡萄糖苷酶可分解這些二糖生成葡萄糖，從而升高血液的血糖值。因此，通過抑制α-葡萄糖苷酶可減少葡萄糖生成量，從而抑制血糖升高。目前，研究者們正致力于從各種各樣的植物中提取α-葡萄糖苷酶抑制物質(zhì)，并將其應(yīng)用于抑制血糖值上升的食品中。
目前為止，有若干關(guān)于計(jì)算α-葡糖苷酶抑制劑的IC50值步驟的報(bào)告，但是卻沒有檢測試劑盒類商品市售。此外，檢測哺乳動(dòng)物小腸來源的α-葡糖苷酶產(chǎn)品很少，其中一部分產(chǎn)品甚至無法保證酶活性。
因此，定量檢測α-葡萄苷酶活性的抑制作用，且具有良好重復(fù)性，是有一定難度的。隨著研究人員對用于定量檢測α-葡萄糖苷酶活性抑制作用試劑需求的增加，在此背景下，Wako開發(fā)了本試劑盒。
研發(fā)過程
在介紹"試劑盒"的開發(fā)過程之前，先說明一下"LabAssay™ 葡萄糖檢測試劑盒"的IC50值檢測和計(jì)算原理（圖1）。
LabAssay™ 葡萄糖檢測試劑盒的檢測原理：當(dāng)顯色溶液作用于樣本時(shí)，樣本中的葡萄糖會(huì)因顯色劑中變旋酶的作用，迅速從α型轉(zhuǎn)換為β型。β-D-葡萄糖在葡萄糖氧化酶（GOD）的作用下被氧化，同時(shí)產(chǎn)生過氧化氫。產(chǎn)生的過氧化氫在共存的過氧化物酶（POD）作用下，與顯色試劑中的苯酚和4-氨基安替吡啉發(fā)生定量氧化縮合，產(chǎn)生紅**素。通過檢測紅**素的吸光度，可定量檢測樣本中的葡萄糖濃度。
圖1．LabAssay™ 葡萄糖檢測試劑盒的檢測原理
基質(zhì)濃度的研討
本來GOD僅與β-D-葡萄糖反應(yīng)，但由于其對麥芽糖也具有弱特異性，因此即使背景上升，也可能無法準(zhǔn)確的評價(jià)抑制作用。因此，要在檢測IC50值的基礎(chǔ)上探討**的麥芽糖濃度。麥芽糖和顯色試劑反應(yīng)30分鐘后，在濃度為18.5mmol/L以下時(shí)，空白吸光度變?yōu)?.1以下，因此采用濃度18.5mmol/L以下作為候選濃度（表1）（制備方法參照圖3）。
表1．麥芽糖濃度的研討
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麥芽糖濃糖（mmol/L）
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0
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7.4
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18.5
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37
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74
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吸光度（A505）
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0.036
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0.057
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0.099
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0.183
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0.337
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接下來，研究濃度為18.5mmol/L以下的麥芽糖中酶活性的結(jié)果，維持酶活性2小時(shí)以上的基質(zhì)濃度為18.5mmol/L，因此麥芽糖的**終濃度定為18.5mmol/L。（圖2）
圖2．酶反應(yīng)曲線
試劑盒中含有的酶試劑是從大鼠小腸來源的刷狀緣膜中提取后，通過離心處理得到的**適成分的懸濁液。若粒子粒徑大，會(huì)迅速沉淀，在收集時(shí)會(huì)導(dǎo)致測量值產(chǎn)生波動(dòng)。因此，為了防止試劑盒中酶試劑的迅速沉淀，采用減小粒子粒徑的制造方法，使測量值不會(huì)產(chǎn)生波動(dòng)。表2顯示了使用阿卡波糖作為抑制劑的三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果（制備方法參照圖3）。
表2．阿卡波糖的IC50值
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基質(zhì)
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IC50值（μg/mL）
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CV值（%）
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麥芽糖
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0.10
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1.8
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蔗糖
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1.28
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0.9
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試劑盒操作步驟
圖3．試劑盒操作步驟
基質(zhì)液和酶稀釋劑等的詳細(xì)制備方法請參考產(chǎn)品附帶的使用說明書。
基質(zhì)液和酶稀釋劑等的詳細(xì)制備方法請參考產(chǎn)品附帶的使用說明書。
在"試劑盒"的基質(zhì)（麥芽糖，蔗糖）溶液中，加入連續(xù)稀釋后的檢測樣本（α-葡糖苷酶抑制劑）溶液以及 "試劑盒"中的α-葡萄糖苷酶懸濁液。在37℃下反應(yīng)后，在沸水浴中加熱使反應(yīng)終止，用"LabAssay™ 葡萄糖檢測試劑盒"定量檢測游離的葡萄糖，并計(jì)算出樣本的IC50值（圖3）。
結(jié)語
本試劑盒的開發(fā)使α-葡萄糖苷酶抑制劑的IC50值的測定成為可能。期待該試劑盒在今后的各種功能性食品的開發(fā)和探索中給與一臂之力。
α-葡萄糖苷酶活性抑制檢測試劑盒
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產(chǎn)品編號
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產(chǎn)品名稱
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規(guī)格
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包裝
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297-78601
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α-Glucosidase Inhibitory Activity Assay Kit
α-葡萄糖苷酶活性抑制檢測試劑盒 |
食品分析用
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96次 |
α-葡萄糖苷酶活性抑制檢測試劑盒能測定對α-葡萄糖苷酶的抑制作用。與LabAssay™ 葡萄糖（血糖）檢測試劑盒配套使用，可用于檢測食品等成分中對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用。
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酶試劑
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1mL
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2
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α-葡萄糖苷酶
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緩沖劑
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50mL用
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2
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馬來酸/順丁烯二酸二鈉
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基質(zhì)液1
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20mL用
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2
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D-(+)-麥芽糖
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基質(zhì)液2
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20mL用
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2
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蔗糖
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陽性對照
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100mg
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1
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阿卡波糖
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*阿卡波糖是一種新型口服降糖藥。在腸道內(nèi)競爭性抑制葡萄糖苷水解酶。降低多糖及蔗糖分解成葡萄糖，使糖的吸收相應(yīng)減緩，因此可具有使飯后血糖降低的作用。
<試劑盒以外所需的器具 器材>
● LabAssay™葡萄糖檢測試劑盒.［產(chǎn)品編號. 298-65701］
● 96孔透明微孔板
● 酶標(biāo)儀（505nm吸光Filter）
● 微量移液器
● 恒溫槽（37℃）
● LabAssay™葡萄糖檢測試劑盒.［產(chǎn)品編號. 298-65701］
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● 微量移液器
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