非洲豬瘟的致死率令養(yǎng)殖場措手不及，侵入豬身體里的病毒為什么可以長驅(qū)直入？有沒有什么辦法能夠阻止它的入侵呢？

       日前，我國復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、遺傳工程國家重點實驗室甘建華課題組與李繼喜課題組合作，研究解析了非洲豬瘟病毒DNA修復(fù)通路上一種關(guān)鍵酶的結(jié)構(gòu)。相關(guān)研究成果在線發(fā)表于《自然·通訊》。

       這種關(guān)鍵酶是連接酶，被稱為基因“針線”，用于將不同的DNA片段連接起來。這次通過解析非洲豬瘟病毒DNA連接酶的分子機制，研究團隊找到了非洲豬瘟病毒的保守位點，為針對非洲豬瘟病毒DNA修復(fù)通路蛋白的藥物設(shè)計提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

       斷尾求生，病毒躲過宿主免疫系統(tǒng)

       “人們會發(fā)現(xiàn)，患了豬瘟的病豬會發(fā)生脾 臟腫大，脾 臟是重要的免疫器官，那說明它的免疫系統(tǒng)‘奮力作戰(zhàn)’了。”李繼喜說，但是非洲豬瘟病毒很聰明，在進入體內(nèi)后會不斷變化，讓免疫系統(tǒng)“抓不到”。

       它的變化很像壁虎的“斷尾求生”。“對于宿主免疫系統(tǒng)要攻擊的DNA片段，它會剪切掉，然后再重新‘長出來’。”李繼喜說。“長出來”意味著DNA的延長、重組，這個過程需要兩種DNA聚合酶（X和P）和一種DNA連接酶。

       “有這3種酶參與的整個過程形成了一套完整的DNA修復(fù)通路。”李繼喜說，團隊已經(jīng)解出了其中的一種聚合酶，文章2017年發(fā)表，揭示了聚合酶X擁有一個獨特的磷酸根識別位點；另一種聚合酶的研究已經(jīng)收尾，正在進行結(jié)果整理和論文編寫工作，至此團隊已經(jīng)“全面打通”整個通路的關(guān)鍵節(jié)點。

       病毒更狡猾的地方在于它新長出來的DNA片段和原來的不同，使得宿主體內(nèi)的免疫系統(tǒng)措手不及，難以鎖定攻擊目標。非洲豬瘟病毒也是如此，其基因組修復(fù)時會發(fā)生突變，讓免疫系統(tǒng)無法精準識別，進而使得針對它們的狙擊，無法奏效。

       分辨率高，晶體法定格“繡娘”手法

       俗話說，“萬變不離其宗”。既然病毒DNA修復(fù)時有千變?nèi)f化，有沒有可能找到所謂的“宗”即保守區(qū)呢？

       這就要對關(guān)鍵酶進行高精度的結(jié)構(gòu)解析。團隊選擇了X-射線晶體學(xué)方法，與聲名鵲起的冷凍電鏡方法相比，前者的分辨率更高，且一旦摸索好條件后，更易重復(fù)。

       結(jié)晶條件的摸索卻是非常艱難的過程。“我們用基因工程的方法，讓非洲豬瘟病毒的連接酶在工程菌中大量表達，通過純化柱等方法將蛋白純化出來。”李繼喜說。這個時候目標蛋白還在溶液中，與同自己性質(zhì)、分子量相近的“兄弟姐妹”在一起。

       團隊進行了上千次相關(guān)參數(shù)的摸索，最終得到了均一性高的**晶型，通過X光衍射、三維重構(gòu)等方法，獲得了分辨率達到2.5埃的連接酶分子結(jié)構(gòu)。

       在超高分辨率下，科學(xué)家可以看到蛋白質(zhì)中每個氨基酸單體的相互作用、電子密度云的情況，目擊氫鍵間的相互連接，從而判斷和預(yù)測作為“繡娘”的DNA連接酶將用哪些可能的針法將什么樣的DNA片段連接起來。

       親見“凹造型”，鎖定藥物設(shè)計潛力點

       預(yù)測之后，必須親見。利用X-射線晶體學(xué)方法獲取酶與DNA作用的“影像”，將對酶與底物相互作用時的“凹造型”一目了然。

       為此，根據(jù)已經(jīng)獲得的連接酶分子結(jié)構(gòu)，參考相關(guān)文獻，團隊設(shè)計了10幾種可能的DNA片段，試試連接酶的“功力”。“DNA片段有長有短，含有的堿基對數(shù)量8到20個不等。”李繼喜說。

       對于這些不同的DNA底物分子，連接酶表現(xiàn)了不同的活性。從本質(zhì)上說，它們之間的反應(yīng)是酶促反應(yīng)。分析發(fā)現(xiàn)，非洲豬瘟病毒連接酶在底物催化位點附近具有一些明顯不同的氨基酸組成。蛋白突變、體外DNA結(jié)合以及活性研究顯示，催化位點附近的氨基酸對其與DNA形成復(fù)合物及活性至關(guān)重要。

       李繼喜解釋道：“單獨的酶的構(gòu)象可以想象成一個三節(jié)棍，當和DNA作用時，這個三節(jié)棍的三段會發(fā)生變化，收攏到一起形成一個‘口袋’狀，把DNA關(guān)在里面，促成DNA連接反應(yīng)的進行。”

       高分辨率結(jié)構(gòu)顯示，該連接酶在N-端具有一個獨特的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（NTD），該結(jié)構(gòu)域?qū)Φ孜锝Y(jié)合十分重要。

       “這就好比‘口袋’入口的地方有個把門的，這個獨特的結(jié)合結(jié)構(gòu)域‘認可’了，才能被連接酶納入到口袋中，促進DNA的反應(yīng)，如果這個‘把門’的不同意，就無法進行DNA的‘縫合’工作。”李繼喜說。

       可以針對這個獨特的位點設(shè)計藥物，阻斷連接酶的工作，進而掌握抑制病毒的方法。“已有研究發(fā)現(xiàn)病毒的成熟顆粒中含有連接酶，也就是說病毒已經(jīng)進入了宿主細胞，并進行了翻譯和組裝之后，才會啟動連接酶的翻譯工作。”李繼喜說，因此以該位點為靶點的藥物并不能預(yù)防非洲豬瘟的感染，而是對豬瘟進行治療。目前，該團隊已經(jīng)開始與北大團隊合作開啟化合物的篩選工作。